蟲草素是從傳統藥用蟲草菌蛹蟲草中分離得到的，因其具有多種臨床功能而受到廣泛關注。既往報道的添加L-丙氨酸可顯著提高蟲草素的產量，但其分子機制尚不清楚。華南農業大學林俊芳教授團隊對添加L-丙氨酸誘導產生兩倍蟲草素的蛹蟲草進行轉錄組分析，發現兩個關鍵的Zn2Cys6型轉錄因子CmTf1和CmTf2通過編碼基因的過表達，被證實具有使蟲草素產量加倍的作用。轉錄數據揭示了蟲草素合成中具有高靈活性的關鍵限速酶和轉錄因子，并繪制了蛹蟲草中從底物氨基酸到產物蟲草素的代謝網絡圖。

L-丙氨酸被證明對產生蟲草素的效果最好（Kang et al.,2014）。為揭示蟲草素的代謝途徑，本研究以L-丙氨酸為誘導劑，提高蛹蟲草中蟲草素的產量。在液體靜態培養基中培養30天后，蟲草素的產量是未添加L-丙氨酸的蟲草素產量的2.1倍（圖1B）。此外，補充提出了變色和原基形成階段。由于蟲草素是一種無色核苷類似物，生長特性中的顏色差異可能是由于較高濃度的色素積累所致（圖1A）。一般來說，原基是由一定數量的蛹蟲草菌絲體聚集而成。菌絲生長速度的提高會積累更多的菌絲，使原基提前產生。蛹蟲草早期原基的形成表明，L-丙氨酸可能通過提高菌絲生長速度來增加蟲草素的產量。

圖1.四個研究樣本的特征。（A）培養30天后在玻璃瓶中的四個樣品的生長特征。（B）每個玻璃罐中的蟲草素產量。

為了弄清從添加的L-丙氨酸到蟲草素的代謝途徑，收集了四個樣品并進行了轉錄組測序。利用蛹蟲草參考數據庫中的注釋對轉錄數據進行了進一步的闡述，結果表明大約80%的基因在蛹蟲草菌絲體期表達。將測序數據上傳到GO和KEGG數據庫。差異表達基因(DEGs)的GO分類結果表明，添加劑可以改善代謝過程，產生更多的代謝物，從而激活膜運輸以避免蟲草素難以負擔的過量生產。KEGG分類顯示大多數DEG與個體生長和代謝途徑有關，這表明補充L-丙氨酸可能會影響特定的氨基酸代謝和能量代謝。KEGG注釋結果和網絡圖，L-丙氨酸可以通過激活氨基酸互變來提高蟲草素的產量。五個氨基酸（半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸和天冬氨酸）在相互轉化中表現出明顯的功能，并直接刺激組氨酸代謝的代謝物質轉化，從而間接參與了蟲草素的合成途徑。KEGG途徑ko01100的顯著變化，表明添加L-丙氨酸增加了能量分子的產生并進一步促進了蟲草素的生產。

圖2.基因本體論和路徑分析。（A）DEG的GO分類（x軸表示DEG的數量，y軸表示GO項）。（B）DEGs的富集。列的顏色表示校正后的P值：（高，黃色；低，橙色）或本體（藍色，分子功能；粉紅色，細胞成分；綠色，生物學過程）。（C）DEG的路徑分類（x軸表示DEG的數量，y軸表示路徑名稱）。

Zn2Cys6型轉錄因子（TF）家族是蛹蟲草子實體形成的重要組成部分。其中影響氨基酸代謝和蟲草素產生的相關基因主要是CCM_02568和CCM_01481。在添加L-丙氨酸的情況下，這些基因在蛹蟲草中過度表達，從而提高了蟲草素的含量。

本研究中的轉錄組數據和先前報道的數據的結合揭示了蛹蟲草發酵過程中L-丙氨酸添加對蟲草素產生影響的可靠代謝網絡圖（圖3）。L-丙氨酸的加入通過激活能量生成和氨基酸相互轉化途徑提高了蟲草素的產量。在能量產生的生物途徑中，激活的丙酮酸激酶和質膜H+-ATP酶直接增加ATP的積累，而Zn2Cys6 TFs（CCM_02568和CCM_01481）以一些未知的方式促進活性，產生更多的能量。額外消耗ATP可產生大量的ADP和AMP，它們是腺苷的前體。另一方面，L-丙氨酸參與了氨基酸的相互轉化，大量的L-丙氨酸加速了氨基酸的形成。這些氨基酸通過組氨酸代謝，間接促進了腺苷前體IMP的積累。腺苷酸、肌苷酸及其中間產物（腺嘌呤、肌苷和腺苷酸琥珀酸）與腺苷反應的酶因腺苷酸和肌苷酸充足而處于活躍階段，因此，過量的腺苷酸和能量增加了蟲草素的產生。

圖3.蟲草中的蟲草素代謝和生物合成途徑。彩色顯示的百分比表示該基因的轉錄水平高于樣品中DEGs的多少基因（CMsI，藍色；CMsII，橙色）的比率。虛線表示間接作用。實線箭頭表示直接作用。

本研究揭示了蟲草素合成中具有高靈活性的關鍵限速酶和轉錄因子，并繪制了蛹蟲草中從底物氨基酸到產物蟲草素的代謝網絡圖。對蟲草素生成的關鍵節點有了清晰的認識，為今后提高蟲草素產量和菌種選育提供了更好的基礎。

原文發表于：Frontiers in Microbiology, 24 April 2020 https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00577 （翻譯：菌物健康）